Proteotypová klasifikace renálního karcinomu ve vztahu k prognóze a terapeutické odpovědi
prof. MUDr. Milan Hora, Ph.D.
Urologická klinika FN Plzeň
Popis projektu
V tomto projektu je FN Plzeň spoluřešitelem. Hlavním řešitelem je Masarykova univerzita, Brno. Jedná se o 4 letý projekt AZV č. NV19-08-00250, který byl zahájen 1. 5. 2019.
Projektu bylo uděleno schválení Etické komise FN a LF UK v Plzni dne 7.6.2018.
ÚVOD
Renální buněčný karcinom (RCC) představuje závažné onkologické onemocnění s nejvyšším výskytem v České republice na celém světě, u kterého stále nejsou k dispozici spolehlivé molekulárně prognostické a prediktivní biomarkery. Zásadní je identifikace nových biomarkerů pro přesnou identifikaci vysoce rizikových pacientů s lokalizovaným RCC i prediktivních biomarkerů pro léčbu metastatického RCC. Zatímco hlavní úsilí při identifikaci a vývoji nových biomarkerů bylo zaměřeno na mRNA, mikroRNA a další nekódující RNA, o proteinech představujících skutečné molekulární efektory v buněčné biologii je známo jen málo. Náš projekt se tedy zaměřuje na identifikaci nových potenciálních proteinových biomarkerů pomocí proteomiky příští generace na základě hmotnostní spektrometrie nezávislého získávání dat (DIA). Tato metoda umožňuje výjimečně dobrou kvantifikaci proteinů ve velkých sadách vzorků24, jak potvrdila naše nedávná studie na 96 tkáních rakoviny prsu25. Nedávno byl navržen nový koncept digitálního biobankingu, který je založen na získávání digitálních otisků vzorků rakoviny a extrakci kvantitativních informací z těchto otisků po akvizici. Zde navrhujeme použití tohoto konceptu pro identifikaci nových prognostických a prediktivních biomarkerů karcinomu ledvinových buněk.
CÍLE
1: Implementace technologie digitálního biobankingu pro rutinní analýzu tkání karcinomu ledvinových buněk
2: Klasifikace lokalizovaného karcinomu ledvinových buněk za účelem identifikace molekulárního vzorce spojeného s vysokým rizikem recidivy onemocnění
3: Klasifikace metastatických karcinomů ledvinových buněk k identifikaci prediktivních biomarkerů nebo molekulárního vzorce spojeného s terapeutickou odpovědí na inhibitory první linie VEGF tyrosinkinázy (TKI)
4: Validace klíčových identifikovaných proteinů k potvrzení jejich role v metastázách karcinomu ledvinových buněk
METODY
Vybereme dobře charakterizovanou sadu 150 lokalizovaných karcinomů ledvinových buněk podtypu čirých buněk. V současné době máme k dispozici takové vzorky pacientů v Masarykově onkologickém ústavu, včetně 120 případů, které byly operovány v letech 2003-2010, což rozšíříme o další pacienty operované v letech 2011-2014. Klíčové klinicko-patologické charakteristiky důležité pro stanovení rizika recidivy jsou k dispozici v nemocničním informačním systému: velikost nádoru, stadium, stupeň, stav lymfatických uzlin, histologie, infiltrace/invaze lymfocytů, přežití bez relapsu a přežití bez vzdálených metastáz. Rovněž získáme informace o nekróze tumoru a/nebo stavu výkonnosti ECOG, abychom mohli vypočítat skóre SSIGN a/nebo UISS pacientů. Všechny základní klinické údaje a také následná data posoudí klinik. Všechny informace o pacientech v datové sadě budou anonymizovány pro další zpracování, splňující všechna zákonná kritéria. Z této sbírky vzorků vygenerujeme konečnou sadu ~ 150 vzorků nádorů stratifikovaných podle skóre SSIGN a/nebo UISS do tří skupin: nízké riziko, střední riziko nebo vysoké riziko. Tato ukázková sada bude dále rozdělena do dvou podmnožin: tréninková sada a ověřovací sada představující základní soubor. Pro následnou analýzu DIA-MS extrahujeme proteiny z čerstvých zmrazených tkání, proteiny strávíme proteázou a výsledné peptidy budeme analyzovat pomocí LC –MS/MS na Orbitrap Fusion Lumos Tribrid nebo Orbitrap HF-X, nebo Bruker TimsTOF Pro hmotnostní spektrometr v režimu DIA (na základě časové dostupnosti nástroje), sdružené a/nebo frakcionované vzorky budou také měřeny v režimu získávání závislých na datech (DDA) pro generování knihovny DIA-MS. Po analýze MS budou získaná data DIA-MS zpracována v softwaru Spectronaut: vygenerujeme knihovnu proteinových testů DIA-MS, na jejímž základě budou z datových sad DIA-MS („digitální otisky prstů“) extrahovány uantitativní informace o úrovni proteinů. ) jednotlivých pacientů. Následná statistická analýza dat bude zahrnovat korelaci hladin proteinů s dostupnými klinicko-patologickými parametry: stupeň tumoru, stav lymfatických uzlin, stav vzdálených metastáz, přežití bez relapsu a přežití bez vzdálených metastáz za účelem identifikace proteinů spojených s těmito faktory vyššího rizika pacientů. K identifikaci klíčových biologických procesů spojených s metastázami RCC bude použita analýza dráhy (GSEA). Rovněž použijeme algoritmus rozhodovacího stromu ke stratifikaci pacientů do rizikových skupin: algoritmus vygeneruje strukturu rozhodovacího stromu, identifikuje klíčové proteiny a stanoví jejich hranice. Nakonec bude výsledný klasifikátor na bázi proteinů porovnán se současnými přístupy založenými na klinických informacích (SSIGN a/nebo UISS) z hlediska schopnosti identifikovat vysoce rizikové pacienty na základě citlivosti, specificity a poměru rizik. Věříme, že nový molekulární klasifikátor poskytne konkurenceschopnou nebo lepší prognostickou hodnotu než aktuální skóre na základě základních klinických parametrů lokalizovaných nádorů. Identifikované proteiny mohou představovat nové potenciální biomarkery a/nebo nové potenciální terapeutické cíle. K identifikaci molekulárního vzorce nebo biomarkerů spojených s účinností první linie terapie VEGF-TKI (sunitinib, pazopanib) metastatického karcinomu ledvinových buněk vybereme dobře charakterizovaný soubor 60–80 metastatických karcinomů ledvinových buněk léčených ve Fakultní nemocnici Plzeň doplněný o další vzorky z Masarykova onkologického ústavu (vzhledem k nízkému výskytu a dostupnosti vzorků v České republice). Účinnost léčby bude hodnocena z hlediska celkové odpovědi, míry kontroly onemocnění, bez progrese a celkového přežití. Údaje o výchozích klinických charakteristikách, objektivní odpovědi a přežití budou zpětně posouzeny lékařem z lékařské dokumentace.
OČEKÁVANÉ VÝSTUPY PROJEKTU
Publikace se očekávají v následujících oblastech a/nebo jejich kombinacích:
- Klasifikace lokalizovaného karcinomu ledvinových buněk za účelem identifikace molekulárního vzorce spojeného s vysokým rizikem recidivy onemocnění.
- Klasifikace metastatických karcinomů ledvinových buněk k identifikaci molekulárního vzorce spojeného s výsledky pacientů léčených VEGF-TKI v první linii.
- Ověření klíčových identifikovaných proteinů k potvrzení jejich molekulární role v RCC metastázách (transgelin a další nově identifikované proteiny). Další výstupy se očekávají jak z předběžných dat, tak z oblasti aplikace DIA-MS. Obecně předpokládaný minimální počet publikací v mezinárodních časopisech s impakt faktorem je 4-5 (Jimp) a minimální počet konferenčních abstraktů je 8. Rovněž zvážíme aplikaci výsledků metody v kategorii „N-metodologie“ národního Registr výsledků výzkumu a vývoje (RIV).
ZÁVĚR
S využitím nové techniky budeme analyzovat dva dobře charakterizované soubory nádorů, výsledná data budou statisticky vyhodnocena za účelem nalezení:
- proteinových biomarkerů identifikujících pacienty s lokalizovaným RCC, ale s vyšším rizikem, kdo by měl být intenzivněji monitorovány a
- proteinové biomarkery spojené se špatnou prognózou metastatického RCC ošetřeného inhibitory tyrosinkinázy v první linii. Očekáváme, že identifikované vzorce, potenciální biomarkery a potenciální terapeutické cíle mohou přispět k efektivnější léčbě pacientů s RCC.