Míra polymorfizmů v NK receptorech a jejich ligandech v rámci české populace
MUDr. Pavel Jindra, Ph.D.
Hematologicko-onkologické oddělení
Popis projektu
V tomto projektu je FN Plzeň hlavním řešitelem. Spoluřešitelskou organizací je Západočeská univerzita. Jedná se o čtyřletý projekt AZV č. NV18-03-00277, který byl zahájen 1. 5. 2018.
Úvod:
Alogenní transplantace hematopoetických buněk je standardní terapií závažných hematologických malignit. I přes zdokonalování vyhledávání vhodných dárců se stále vyskytují časté komplikace jako reakce štěpu proti hostiteli či relaps. Počet dárců v registrech stále stoupá a mnohdy je možné vybírat pro jednoho pacienta z několika alternativních dárců. Mnohá transplantační centra již zavedla výběr na základě dalších kritérií, než je běžně používaná shoda v „klasických“ HLA genech např. permisivitu HLA-DPB neshod. Stále více se vyšetřují i shody/neshody v molekulách, s potenciálem vlivu na výsledek transplantace, jako např. KIR receptory NK buněk. Vedle KIRů je možné stanovit i shodu/neshodu v jiných receptorech a jejich ligandech a tyto údaje mohou být použity při volbě nejlepšího dárce. V ČR je standardním kritériem HLA shoda, případně permisivita HLA-DPB, u myeloidních malignit se určuje genotyp KIR. Začlenění dalšího kritéria vyžaduje představu o míře polymorfizmů v klíčových molekulách v rámci české populace, aby se zvolilo nejlepší sekundární či terciární kritérium pro výběr dárce.
Cíl:
Cílem projektu je sledovat zastoupení jednotlivých polymorfizmů v české populaci a zvolit další možné kritérium pro výběr nejlepšího dárce pro konkrétního pacienta. Dílčím cílem je zjistit, zda existuje spojitost mezi přítomností/nepřítomností některé alely, popř. alelické skupiny a jejich kombinace s přítomností hematologické malignity.
Metodika:
Biologický materiál
Krevní vzorky pro izolaci DNA budou získány od zdravých dárců a pacientů s leukémií (HOO FN Plzeň). DNA od pacientů je použita pro retrospektivní i prospektivní studii. DNA zdravých dárců je použita pro testování zdravé populace. Celkem je v plánu analyzovat 800 vzorků občanů České republiky, z toho 120-150 pacientů s leukemií pro definici možných predispozic sledovaných polymorfizmů.
Analytické metody
Typizace KIR bude provedena pomocí sekvenování nové generace (NGS). Z těchto analýz budou určeny jednotlivé alely a také počty kopií genů. Dalším sledovanými molekulami budou klíčový receptor NK buněk – NKG2D – a jeho hlavní ligandy MICA a MICB. Tyto molekuly budou charakterizovány pomocí Sangerova sekvenování.
Analýza dat
Pro vyhodnocení výsledků NGS a Sangerova sekvenování bude navržen na míru sestavený analytický nástroj, který umožní přesné a v klinické praxi aplikovatelné vyhodnocování laboratorních výsledků.
Očekávané výsledky:
Základními výsledky budou tři publikace zveřejněné v impaktovaných časopisech. První bude definovat polymorfismus v KIR genech a druhý bude o NKG2D, MICA / B polymorfismu a výskytu haplotypů v české populaci. Třetí publikace vyhodnotí, zda existují rozdíly mezi pacienty a zdravými dárci resp. zda existuje spojitost mezi detekovanými polymorfizmy a klinickým outcomem pacientů. Kromě publikační činnosti bude připravena aktualizace databáze pro vyhledávání dárců.
Dosavadní výsledky:
V rámci projektu je aktuálně zařazeno celkem 810 českých občanů, z toho je 150 pacientů s diagnózou akutní myeloidní leukemie (AML). U 80 pacientů se podařilo získat také párové vzorky, což znamená, že jsou analyzovány vzorky před HSCT (pacient) a po HSCT (dárce) s možností stanovení match a mismatch v jednotlivých parametrech. Sanger sekvenování pro stanovení MICA, MICB a NKG2D polymorfismů je provedeno u zhruba 95 % vzorků. U těchto analýz také probíhá vyhodnocování možných spojitostí detekovaných polymorfizmů a výsledků po transplantaci.
Z prvotních výsledků vyplývá, že rozložení alel se příliš neliší od výsledků německé studii publikované v roce 2020 (https://doi.org/10.3389/fimmu.2020.00314). Nejčastější variantou u MICA byla identifikována skupina *008/027/102/103/104 (liší se pouze na exonu 5) a MICB*005/003. V rámci studia NKG2D a jeho ligandů bylo připraveno review, které je publikováno v časopise Fronties of Immunology (IF 2020: 7,56).
Analýzy KIR receptorů prokázala shodu nově navrženého algoritmu hodnocení (high-resolution) a komerčního low-resolution hodnocení. Analýza KIR receptorů je provedena u 3/4 souboru. Data byla částečně publikována ve studii, která se zabývá změnami exprese inhibičních KIR receptorů po alogenní transplantaci (Dekojová et al. J. Clin. Med. 2020, 9(11), 3502). Jedná se o studii mimo původní plán, která bude sloužit jako preliminary data pro plánovanou navazující studii na tento projekt (podání u AZV 06/2021). Pro tuto studii bylo použito prototypové řešení analytického nástroje navržené spoluřešitelem, nicméně v tuto chvíli dochází k vylepšování s ohledem na CNV a specifika jednotlivých genů a alel, aby mohl být analytický nástroj snadno implementovaný v klinické praxi. Nejčastější alelou pro KIR2DL1 byla * 002 (více než 1/3 dárců); pro KIR2DL2 byla * 003 (1/2); pro KIR2DL3 byl * 001 (1/2); pro KIR3DL1 byla * 001 (1/3); a pro KIR3DL2 byla * 001. Přítomnost KIR2DL5 byla detekována přibližně u 2/3 pacientů (s dominancí KIR2DL5A * 005-KIR2DL5B * 002), ale někteří z nich nebyli přepsáni. Parciální analýzou dárcovských dat bylo identifikováno nejvíce polymorfických variant u KIR genu KIR3DL2 s nejčastější identifikovanou alelou *001, výsledky poukazují na podobné rozložené alel, jako je tomu u sousedního Německa (https://doi.org/10.3389/fimmu.2018.02843).
Prezentace výsledků:
Na konferenci ČSAC (2019) byl představen projekt příspěvkem s názvem „KIRnome analysis for improved transplantation efficiency“ (Pavel Pitule) a na konferenci DNA (2019) v Brně byla představena metoda NGS sekvenování pro účely KIR analýzy pomocí příspěvku „Stanovení polymorfizmů KIR receptorů v rámci české populace pomocí NGS“ (Eva Kralovcová). Metodika pro KIR analýzu (vyhodnocovací algoritmus NGS dat) a samotný nástroj pro identifikaci alel byl prezentován příspěvkem na konferenci NK2019 v Lucembursku v podobě posteru s názvem „KIR alleles identification for HSCT clinical practice“ (Lucie Houdová), kde byla také prezentován poster s názvem „A dynamics of inhibitory KIRs receptors after allogeneic HSCT“ (Monika Holubová). Projekt byl prezentován v podobě online přednášky na ČSAKI 2020 Lucií Houdovou (live streamování z Prahy) a v podobě komentovaného posteru také na konferenci 21. pražské hematologické dny – Hematologie 2021 – Post-ASH (Pavel Jindra). Část projektu byla prezentována ve formě přednášky na Světovém dni imunologie 2021 (Alena Machuldová).
Projekt byl schválen dne 29.6.2017 společnou Etickou komisí FN a LF UK v Plzni.