Multiparametrická non-coding RNA
RNDr. Windrichová Jindra Ph.D.
Cílem předkládané studie je zavedení a ověření použitelnosti technologie RT-PCR karet (TaqMan Array Cards) pro screening až 96 molekul nekódujících RNA pro multiparametrickou evaluaci biomarkerů z oblasti nekódujících RNA v cirkulaci, měřené v séru nebo plazmě, tj. cell-free RNA (cfRNA) fluidní biopsie. Tato technologie bude v budoucnu aplikovatelná na selekci biomarkerů pro různé diagnózy nebo klinické otázky. Pro ověření přínosu pro klinické aplikace je v projektu navržena selekce kandidátů biomarkerů z oblasti nekódujících RNA se zaměřením na long-noncoding RNA v cirkulaci, tj. v séru nebo plazmě pro predikci úspěšnosti léčby u pacientů s nemalobuněčným karcinomem plic (NSCLC) a karcinomem prostaty (PCa) – podrobně v klinických cílech projektu.
Nové biomarkery jsou potřebné pro další stratifikaci pacientů v těchto diagnózách, která by umožnila personalizovat četnost provádění kontrolních vyšetření u diagnostikovaných pacientů, zvážení používání adjuvantní léčby, radikálnosti operací (zabránit overtreatment) dále vybrat pro pacienty vhodnou léčbu a monitoraci její úspěšnosti s možností včasné změny protokolu např. u pacientů s metastatickým kastračně-rezistetním PCa posoudit vhodnost antiandrogenní léčby Androgen Receptor-Targeted Agent (ARTA) versus chemoterapie (Matsubara et al., Clin Genitourin Cancer. 2017;15(6):e1073-e1080).
Klinické cíle projektu:
• 1) NSCLC část projektu je zaměřena na identifikaci pacientů s vysokým rizikem časného relapsu u časných stadií NSCLC (st. I, II) po radikální chirurgické resekci. Důsledkem evaluace biomarkeru pro rozlišení pacientů s rizikem časného relapsu by mělo být intenzivní sledování pacienta s častým prováděním kontrolních zobrazovacích vyšetření a rovněž zvážení podání adjuvantní systémové léčby. Bude zařazeno do 50 pacientů NSCLC skvamozního histologického typu s kvalitním a dostatečně dlouhým follow-up, kteří budou rozděleni na skupinu s časným relapsem a bez relapsu.
• 2) PCa část projektu je zaměřena na predikci efektu systémové léčby u pacientů s metastatickým kastračně-rezistetním PCa (mCRPC). Zejména jde o selekci pacientů s dobrou odpovědí na léčbu antiandrogeny nové generace (ARTA), které představují významnou moderní modalitu systémové léčby mCRPC, avšak jedná se o léčbu značně nákladnou a u řady pacientů málo efektivní. Pomocí těchto prediktivních biomarkerů by bylo možné selektovat pacienty vhodné k léčbě ARTA nebo k podání chemoterapie (docetaxel) a tím zvýšit efektivitu zvolené léčebné modality. Bude zařazeno cca 100 pacientů s mCRPC, pro první pilotní měření bude primárně vybráno do 50 pacientů, kteří budou rozděleni podle odpovědi na systémovou léčbu (good vs. poor responders).
Biomarkery, které budou vyselektovány retrospektivně jako kandidátní pro dané klinické problematiky budou dále prospektivně evaluovány technologií RT-PCR.
Veškeré postupy odpovídají zásadám Správné klinické praxe, nejedná se o použití experimentálních léků - není farmakologická, firemní a není sponzorovaná. Jedná se o neintervenční studii, kde pacienti nebudou zatíženi žádným nadbytečným nebo experimentálním diagnostickým ani terapeutickým úkonům. Pro studii bude využito biologického materiálu (séra, plazmy) uskladněného v biobance FN Plzeň.
Analýza rizik:
Potenciálním rizikem pro průběh výzkumu je selhání technické metodiky analytického stanovení především z pohledu citlivosti metodiky pro fluidní noncoding RNA biopsie z periferních vzorků séra nebo plazmy. Vzhledem k tomu, že se jedná o zavádění nového laboratorního přístupu a v odborné literatuře není pro periferní vzorky séra a plazmy pro lncRNA dostatek multiparametrických dat není možné dopředu toto riziko eliminovat. Vycházíme ovšem z předpokladu, že skupina mikroRNA z rodiny nekodujících RNA je v periferních vzorcích séra a plazmy detekována.
Obecná charakteristika projektu
Long noncoding RNAs (lncRNA) jsou typem nekódujících RNA, a jak se ukázalo v poslední desetiletí, mají významnou roli v patofyziologii vzniku a regulaci nádorového bujení (Bartonicek et al., Molecular Cancer (2016)15:43). Jsou tedy potenciálními onkomarkery například pro kolorektální karcinom (Saus et al., Front Genet. 2016;7:54), karcinom prostaty (Xu et al., 2018;17(1):103.), karcinomy plic (Ghafouri-Fard et al., Exp Mol Pathol. 2020;114:104411), karcinomy ovaria (El-Shal et al., IUBMB Life. 2019;71(12):2031-2047). Močový marker PCA3, patřící k lncRNA, je dokonce FDA uznán pro detekci karcinomu prostaty. Mezi dosud nejčastěji studované lncRNA u karcinomu prostaty patří například MALAT1, SChLAP1, Prostate cancer noncoding RNA-1 a HOTAIR. (Misawaet al., Cancer Sci 108 (2017) 2107– 2114). LncRNA jsou i významným patofyziologickým mechanismem pro resistenci/sensitivitu k protinádorové léčbě. (Liu K et al., Molecular Cancer. 2020 Mar;19(1):54. DOI: 10.1186/s12943-020-01162-0). Využití technologie RT-PCR karet (TaqMan Array Cards) popsané v literatuře bylo dosud omezeno spíše na microRNA a se zaměřením na tkáně s menší dostupností biologického materiálu, například klasifikace karcinomů štítné žlázy (Rosignolo et al., Int J Oncol. 2017 May;50(5):1767-1777. doi: 10.3892/ijo.2017.3960.), nádory slinných žláz (Binmadi et al., Oral Dis. 2018 May;24(4):537-543. doi: 10.1111/odi.12800), diagnostika z biopsie duktálních adenokarcinomů pankreatu (PDAC) (Gress TM, Oncotarget. 2017 Nov 21;8(64):108223-108237. doi: 10.18632/oncotarget.22601.) nebo hladiny exosomální microRNA například u ovariálního karcinomu (Pan et al., Mol Oncol. 2018 Nov;12(11):1935-1948. doi: 10.1002/1878-0261.12371) Zajímavostí je verifikace této technologie pro stanovení microRNA v mozkomíšním moku. (Lusardi et al. Mol Neurobiol. 2019 Jul;56(7):4988-4999. doi: 10.1007/s12035-018-1422-0).
V čem je pojetí projektu nové
multiparametrické stanovení lncRNA v cirkulující krvi
Souvislost s činností FN Plzeň
výzkum v oblasti onkologie, cílené terapie a biomarkerů
Souvislost s předchozím výzkumem
návaznost na studium biomarkerů u daných dg. na našem pracovišti v několika grantových a projektových studií, s aplikačními i publikačními výstupy
Přínos pro FN Plzeň
Do budoucna může být výstupem zavedení nových jednotlivých nebo multiparametrických biomarkerů pro klinické vyšetření, v jejímž důsledku by došlo k zlepšení efektivity péče o pacienta dané dg. tj. přínosem pro personalizaci/adekvátní výběr léčebných přístupů pro pacienty a také zlepšení ekonomické efektivity, publikační činnost
Metodika výzkumu
Skupiny nemocných (charakteristika a reálné počty nemocných, ev. kontrolní skupiny)
38 předoperačních náběrů od pacientů s časným stadiem NSCLC skvamozního typu (st. I, II).
100 pacientů s pokročilým karcinomem prostaty, dle typu léčby bude primárně vybráno 40 pacientů pro první pilotní měření a pro porovnání bude zařazeno 40 pacientů s benigní hyperplazií prostaty.
Konkrétní použité metodiky
Izolace RNA ze séra nebo plazmy a navazující multiparametrická RT-PCR pro analýzu ncRNA molekul Přístroje:
- MagNA Pure Compact
- QuantStudio 7 Flex s TaqMan Array Card
Po odebrání periferní venózní krve je separována plazma/sérum centrifugací na 1700 rcf po dobu 10 min při 4 °C a následně uložena na – 80 °C do dalšího zpracování. Izolace RNA ze séra nebo plazmy probíhá pomocí automatizovaného přístroje MagNA Pure Compact a izolačních souprav k přímému použití
(ready-to-use). Princip přístroje spočívá v technologii izolace pomocí magnetických kuliček.
Po izolaci RNA je nutné RNA převést na cDNA pomocí reverzní transkripce. Při zjištění nízké výtěžnosti RNA po izolaci je možné ještě doplnit preamplifikaci před samotnou analýzou. Následná analýza je prováděna pomocí přístroje Quant Studio 7 ve formě real-time PCR na TaqMan Array Card. Tyto karty umožňují multiparametrickou analýzu několika lncRNA najednou s možností využití několika exo- a endogenních kontrol (např. GAPDH, 18S,…). Karta umožňuje analýzu až 384 analytů pro jeden vzorek nebo 48 analytů pro 8 vzorků. Sondy TaqMan jsou hydrolyzační sondy navrženy tak, aby zvyšovaly specificitu kvantitativní PCR. Princip spoléhá na exonukleázovou aktivitu 5´ – 3´ polymerázy Taq, štěpení duálně značené sondy během hybridizace s komplementární cílovou sekvencí a detekci na bázi fluoroforu. Výsledný fluorescenční signál umožňuje kvantitativní měření akumulace produktu během exponenciální fáze PCR.
Metodiky zajišťované pracovištěm řešitele
izolace RNA a stanovení profilu cirkulující lncRNA pomocí RT-PCR
Metodiky zajišťované spolupracujícími pracovišti FN Plzeň
Onkologická a radioterapeutická klinika - sběr klinických dat ze zdravotnické dokumentace a rutinní odběr venózní krve
Řešení projektu
Přesný popis systému sběru vzorků, shromažďování výsledků
Bude využit biologický materiál periferní žilní krve z ukončeného grantu NR 9343-3 nebo zbytkový mat. pro rutinní lab. vyšetření. Nebudou prováděna žádná doplňující klinická vyšetření.
Ukládání získaných vzorků
vzorky pro NSCLC jsou uskladněny od ukončení grantového projektu v biobance FN Plzeň a pro karcinom prostaty (rutinní odběry venepunkcí) budou shromažďovány po rutinním zpracování dle pracovního postupu pro příjem biologického materiálu a po rutinní analýze v laboratoři OID a skladovány v biobance
Organizace klinického sběru dat a databáze výsledků
S daty ze studie bude nakládáno anonymně, tj. každý pacient má přiřazené číselné ID, které bude použito pro zpracování laboratorních výsledků v databázi včetně propojení s věkem pacienta a klinickými kritérii. Bude vedena odděleně databáze pro NSCLC a pro karcinomy prostaty.
Statistické zpracování
• porovnání hladiny mezi pacienty s neúspěšnou léčbou a ostatními, rozdělení do skupin podle (již dostupného) follow-up
• předpokládáme použití statistických testů s korekcí p –value na malé soubory a na případné vzájemné vztahy s cílem omezit false discovery rate (FDR) - př. Benjamini-Hochberg, Bonferroni
• explorativní metodika pro selekci nejlepšího kandidátního markeru nebo kombinace, kterou umožní velikost souboru
• pro výběr normalizace RT-PCR dat bude využita metodika softwaru Normfinder